化學發光是在常溫下由化學反應產生的光的發射。其發光機理是：反應體系中的某些物質分子，如反應物、中間體或者熒光物質吸收了反應釋放的能量而由基態躍遷到激發態，當中間體由激發態回到基態時會釋放等能級的光子，對光子進行測定而實現定量分析［1］。 化學發光免疫分析方法是將化學發光與免疫反應相結合的產物，因化學發光具有熒光的特異性，但與熒光產生需要激發光不同，化學發光由化學反應產生光強度，并不需要激發光，從而避免了熒光分析中激發光雜散光的影響?；瘜W發光免疫分析包含了免疫化學反應和化學發光反應兩個部分。免疫分析系統是將化學發光物質或酶標記在抗原或抗體上，經過抗原與抗體特異性反應形成抗原－抗體免疫復合物?；瘜W發光分析系統是在免疫反應結束后，加入氧化劑或酶的發光底物，化學發光物質經氧化劑的氧化后，形成一個處于激發態的中間體，會發射光子釋放能量以回到穩定的基態，發光強度可以利用發光信號測量儀器進行檢測。待測物質濃度因為與發光強度成一定的關系而實現檢測目的［2］。
一、化學發光免疫分析方法的類別化學發光免疫分析法根據標記物的不同可分為3 大類， 即化學發光免疫分析、 化學發光酶免疫分析和電化學發光免疫分析法。（一）化學發光免疫分析 化學發光免疫分析是用化學發光劑直接標記抗體或抗原的一類免疫測定方法。目前常見的標記物主要為魯米諾類和吖啶酯類化學發光劑。
1. 魯米諾類標記的化學發光免疫分析 。 魯米諾類物質的發光為氧化反應發光。在堿性溶液中，魯米諾可被許多氧化劑氧化發光，其中H2O2最為常用。因發光反應速度較慢，需添加某些酶類或無機催化劑。酶類主要是辣根過氧化物酶（HRP），無機類包括O3、鹵素及Fe3+、 Cu2+、 Co2+和它們的配合物。魯米諾在堿性溶液下可在催化劑作用下，被H2O2等氧化劑氧化成3－氨基鄰苯二酸的激發態中間體，當其回到基態時發出光子。魯米諾的發光光子產率約為0.01，最大發射波長為425 nm。 2. 吖啶酯類標記的化學發光免疫分析 吖啶酯用于化學發光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay， CLIA）由 于 熱 穩 定 性 不 是 很 好，Klee 等研究合成了更穩定的吖啶酯衍生物 。 在含有H2O2的堿性條件下，吖啶酯類化合物能生成一個有張力的不穩定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解為CO2和電子激發態的N－甲基吖啶酮， 當其回到基態時發出一最大波長為430 nm 的光子。 吖啶酯類化合物量子產率很高，可達0.05。吖啶酯作為標記物用于免疫分析，發光體系簡單、快速，不需要加入催化劑，且標記效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物應用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作為發光啟動試劑， 有些在發光啟動試劑中加入Triton X－100， CTAC， Tween－20等表面活性劑以增強發光。（二）化學發光酶免疫分析 化學發光酶免疫分 析（ Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶標記生物活性物質進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發光底物，在信號試劑作用下發光，用發光信號測定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP），它們有各自的發光底物。HRP 最常用發光底物是魯米諾及其衍生物 。在CLEIA 中， 使用過氧化物酶標記抗體， 進行免疫反應后，利用魯米諾作為發光底物，在過氧化物酶和起動發光試劑（NaOH和H2O2）作用下魯米諾發光，酶免疫反應物中酶的濃度決定了化學發光的強
度。此傳統的化學發光體系（HRP－H2O2－lumi-nol）為幾秒內瞬時閃光，存在發光強度低、不易測量等缺點。后來，在發光系統中加入增強發光劑，以增強發光信號，并在較長時間內保持穩定，便于重復測量，從而提高分析靈敏度和準確性。堿性磷酸酶（ALP）已廣泛用于酶聯免疫分析和核酸雜交分析。
堿性磷酸酶和1， 2－二氧環己烷構成的發光體系是目前最重要、最靈敏的化學發光體系。這類體系中具有代表性的是Bronstein 等提出的ALP－AMPPD 發光體系。 AMPPD 為 1， 2－二氧環己烷衍生物，它是一種生物化學領域中最新的超靈敏的堿性磷酸酶底物，其特點是反應速度快，在很短時間內提供正確可靠的結果。在它的分子結構中有兩個重要部分，一個是聯接苯環和金剛烷的二氧四節環，它可以斷裂并發射光子；另一個是磷酸根基團，它維持著整個分子結構的穩定。（三）電化學發光免疫分析方法 電化學發光是指由電化學反應引起的化學發光過程。 Leland［3］
等已對三聯吡啶釕體系的電化學發光機理進行了深入的研究。電化學發光的反應在電極表面進行，發光 底 物 為 三 聯 吡 啶 釕［ Ru （ b p y）32+］ ，三 丙 胺（TPA）用來激發光反應。在陽極表面，兩種物質同時失去電子。在電極板上Ru （bpy）32+被氧化成Ru （ b p y）33+， TPA也 被 氧 化 成 陽 離 子 自 由 基（TPA+ *）， TPA+ *自發地釋放一個質子而變成非穩定分子（TPA*） ，將一個電子遞給Ru （bpy）33+，形成激發態的Ru （bpy）32+*。 Ru （bpy）32+*在衰減的同時發射一個波長為620 nm 的光子， 重新回到基態Ru （bpy）32+。這一過程在電極表面反復進行，產生高效、穩定的連續發光，并不斷增強。二、化學發光免疫分析方法的應用自1977 年 Halman 等［4］創立化學發光免疫分析方法以來，免疫化學分析方法在醫學檢驗、食品安全及環境科學方面的應用取得了很大的進展。（一）醫學檢測 肺結核病常以人體血清中CA125 含量為疾病標記物， 上海交通大學 Wang 等［5］建立了CA125 的毛細管化學發光免疫分析方法 ，以實現對肺結核病的檢測。其方法的線性檢測范圍為2.5×10－11～1.0×10－9mol/L，檢測限（S/N=3）為1.0×10－12mol/L，且標樣的添加回收率為93％～109％。甲胎蛋白（AFP）為腫瘤疾病標志物， Yang等 ［6］利用鏈霉素化毛細管柱，建立了AFP 的化學發光免疫分析方法。該方法的最低檢測限為0.1ng/mL，線性檢測范圍為0.5～200 ng/mL。研究結果表明該方法具有結構簡單、更好的實用性及較寬的線性范圍等優點。 Zhang等［7］利用磁性微粒子和包被小管建立了AFP 的化學發光酶免疫分析方法。
在該方法中， AFP抗體首先包被于兩種不同的固相載體上，如磁性微粒子和包被小管。再分別對這兩種包被模式建立的化學發光免疫分析方法進行比較，通過再抗體包被濃度、標記于抗體上HRP 的稀釋比例，分析所需時間，化學發光動力學等角度進行衡量，顯示磁性微粒子具有較大的優勢。Zhan 等［8］建立了C 反應蛋白的電化學發光免疫分析方法。首先用生物素標記含有Ru （bpy）32+的脂質體后與親和素反應，再與生物素化的C 反應蛋白抗體結合得到抗體包被的脂質體，同時親和素包被的磁性微粒子與生物素化的抗體反應，得到抗體包被的磁性微粒子。兩種抗體與C 反應蛋白結合，構成雙親和素橋聯的、磁性微粒子為固相分離劑的反應模式。 通過溶解脂質體釋放出Ru （bpy）32+測定其強度進行測定。該方法的最低檢測限為100ng/mL，檢測范圍為100ng/mL～10μg/mL。Knight 等［9］采用化學發光免疫夾心分析方法對梅毒病毒進行檢測，并與傳統的分析方法快速血漿素反應（RPR）和酶免疫分析方法（ELISA）進行比較，通過對多種樣品進行檢測，并與RPR 及ELISA分析方法結果有 99.1％的正確率。茶堿是一種磷酸二酯酶（PDE）抑制劑，用于呼吸系統疾病的治療。
Zhou等［10］建立了茶堿的化學發光免疫分析方法，該方法的最低檢測限為0.51mg/L，線性范圍為0.51～40mg/L，板內及板間變異系數分別為3.20％和 3.57％。 通過與 FPIA 結果 對30 例 茶 堿 濃 度 進 行 比 較 ， 其 相 關 系 數 為0.993。Peter 等［11］通過合
成生物素睪酮標記物建立了睪酮的化學發光免疫分析方法，該方法的檢測范圍為0.2～20.0 nmol/L，最低檢測限為0.125 nmol/L，板間方法的精密度為13％～16％，通過質譜儀器確證其方法的回收率為95％，顯示了方法良好的靈敏度和準確率。 Mirasoli等［12］建立了唾液中皮質醇的固相競爭化學免疫分析方法。通過人工重組的發光蛋白標記皮質醇而建立的免疫分析方法檢測限為3nmol/L，線性檢測范圍為10～1 000 nmol/L。其他關于這方面報道還有Perschel 等［13］通過化學發光免疫分析對原發性醛固酮過多癥（PHA）進行快速篩選， Tudorache等［14］利用磁顆粒免疫支持液膜方法（m-ISLMA）檢測唾液中的孕酮含量，Iwata 等［15］利用雙夾心化學發光免疫分析方法測定血漿中內皮素－1的含量等。關于這方面的應用，化學發光免疫分析方法應用的最為廣泛，正是在醫學檢測方面大量成功的應用，帶動了化學發光免疫分析方法在其他學科方面的普及。 （二）食品安全檢測Quan 等［16］建立了食品中伏馬菌素B1 的化學發光酶免疫分析方法， 經方法優化后其線性檢測范圍為0.14～0.9μg/L，方法的靈敏度（IC50）為0.32 μg/L，方法的最低檢測限（IC10）為0.09 μg/L，與伏馬菌素B1 的 ELISA 方法相比，其方法靈敏度提高了10 倍。 且通過樣品的添加回收率試驗表明其有良好的回收率，其分析結果與ELISA 分析方法與 HPLC 方法有良好的相關性。 Yang等［17］建立了食品中葡萄球菌腸毒素B（SEB）的碳納米管的化學發光免疫分析方法，通過將SEB 抗體吸附在碳納米管表面 ， 然后將抗體－碳納米管固定在聚碳酸酯表面， 再通過增強化學發光免疫法測定SEB 含量。 牛奶、 蘋果汁和嬰兒食品中的SEB 最低檢測限為 0.01 ng/mL， 而ELISA 的最低檢測限為 1 ng/mL。Lin 等［18］人建立了食品中氯霉素的化學發光免疫分析方法，其方法靈敏度（0.05 ng/mL）、精密度、特異性及準確度等指標均與ELISA 分析方法類似。 10個樣品的板內和板間變異系數分別小于8％和 20％， 且樣品的添加回收率在 87％～100％。
四川大學華西醫學院楊秀岑等人［19］建立了食品中沙門氏菌的化學發光免疫分析方法。該方法選用聚氯乙烯平片作為載體固定細菌，再與一抗及HRP 標記二抗溫育，以化學發光免疫法測定食品中沙門氏菌。利用該方法對62 份食品樣品進行檢測 ， 以P/N≥3作為陽性標準，符合率為85.5％。Magliulo 等［20］建立了牛奶中黃曲霉毒素M1的化學發光酶免疫分析方法，通過將黃曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通過酶標二抗在含有魯米諾的基板上進行檢測。該方法的最低檢測限為1 pg/mL，且板間板內數據的變異系數均低于9％，回收率在96％～122％之間。 Lin 等［21］建立了農產品中黃曲霉毒素B1 的化學發光免疫分析方法。該方法線性檢測范圍在0.05～10 ng/g 之間 ，檢測靈敏度為0.01 ng/g，板間及板內變異系數分別為12.2％及 10.0％。 農產品中樣品添加回收率在79.8％～115.4％之間。 同時， 將建立的分析方法與黃曲霉毒素商品化酶聯免疫試劑盒進行了相關性試驗，相關系數為0.9098，顯示其有較好的應用前景。 Alexandra 等［22］通過酶聯免疫法和化學發光酶免疫法建立了DDT 及其代謝物的免疫分析方法 ，并對食物及環境樣品中的DDT 及其代謝物進行檢測。對DDT 及其代謝物， 酶聯免疫法的 IC50值為0.6 ng/mL，而化學發光酶免疫法的IC50值為0.2ng/mL。 David等［23］通過流動注射化學發光檢測法對水樣中的阿特拉津進行檢測，對水樣的最低檢測限為1.3 ng/mL，檢測線性范圍為2.15～150 ng/mL，通過SPE 柱凈化濃縮后， 對水樣的最低檢測限為14 ng/L。 Samsonova等人［24］利用化學發光免疫分析方法建立了3 種三氮苯類除草劑 （阿特拉津、 草凈津和莠滅凈）的多殘留免疫分析方法。在用建立的方法對含3 種除草劑混合物的環境樣品進行檢測，檢出正確率為70％～100％。 Waseem等人［25］通過流動注射化學發光免疫分析方法建立了除草劑西草凈的檢測方法，該方法的線性檢測范圍為0.01～2μg/mL，最低檢測限（S/N=3）為7.5 ng/mL， 4條標 準 曲 線 各 抑 制 率 的 相 對 標 準 偏 差 為0.9％～2.3％。
