化學發光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）在近十年來得到了很大發展，與微離子發光酶免疫分析(microparticle luminescence immunoassay, MLIA)、生物發光免
疫分析(bioluminescence immunoassay, BLIA)、增強化學發光分析(enhanced chemiluminescence, EC)和電化學發光分析(electrochemical luminescence, ECL)等相比，以其靈敏度高（可達10-18mol）、檢測速度快、操作簡便、所用試劑對人體無危害的優點，
成為非放射性免疫分析技術中最具有發展前途的方法之一。
（一）化學發光免疫分析的基本原理
化學發光指化學反應引起的發光現象，當物質吸收化學反應過程中釋放的化學能之后，能使自身分子受激發而發光；如在生物體中產生此種能源來自生物活體的發光現象，稱為生物發光；若產生發光信號的能量來源于電激發，如從多環芳烴的自由基陰離子上除去一個電子，往往產生激發狀態的中間物質，當其回到基態時，將產生光輻射，此種發光稱為電化學發光?；瘜W發光反應所發出的光的強度依賴于化學發光反應的速度，而反應速度又依賴于反應物的濃度。因此，通過檢測化學發光強度可以直接測定反應物的濃度，從而進行物質的定性和定量分析?；瘜W發光與熒光的根本區別是形成激發態分子的激發能源不同。熒光是發光物質吸收了激發光后使分子產生發射光，化學發光是化學反應過程中所產生的化學能使分子激發產生的發射光。因此，化學發光反應中反應過程必須產生足夠的激發能是產生發光效應的重要
條件。
（二）化學發光兔疫分析中的標記物質
化學發光免疫分析所使用的標記物根據其參與的化學反應不同，可分為三類：①直接參與發光反應的標記物；②以催化作用或能量傳遞參與發光反應的酶標記物；③以能量傳遞參與氧化反應的非酶標記物。后兩者又稱為間接發光。這些標記物應用在不同的發光免疫分析儀器中，了解它們各自特性有助于對不同原理的發光免疫分析在分析測定樣品時的特性進行評價
和選擇。
1．直接參與發光反應的標記物 待測樣品作為反應物，直接參與化學發光反應，如下式。待
測樣品A或B，通過反應產生激發態產物C* 當C* 躍遷回到基態時，輻射出光子。
A + B C* + D C* C + h
這類反應的標記物在化學結構上有產生發光的特殊基團，在發光免疫分析過程中直接參與發光反應。通常這類物質沒有本底發光，在反應中能用于檢測低濃度或微量濃度的樣品。最常用的標記物主要有吖啶酯類。吖啶酯包括吖啶酯I、吖啶酯II和吖啶酰胺III，是一類發光效率很高的發光劑。吖啶酯I、II分子和吖啶酰胺III均可與抗體（或抗原）結合，生成具
有化學發光活性強、免疫反應特異性高的標記抗體。
2． 以催化反應或能量傳遞參與發光的酶標記物 在這類發光反應中，采用某些酶作為標記
物，這類標記物作為發光反應的催化劑或作為一種能量傳遞過程中的受體，其本身又直接參與發光反應。通常用酶標記抗體，檢測反應中形成的抗原抗體復合物上的標記酶催化其反應底物后形成的產物，作用于發光物質產生化學發光。該被測樣品的含量和發光效率的強弱與酶催化反應后形成產物的量密切相關。在該類方法中最常使用的標記酶有辣根過氧化物酶
（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）。
3．以能量傳遞參與氧化反應的非酶標記物 這類標記物作為化學發光反應的催化劑或能量傳遞過程中的中間體（或受體），不直接參與化學發光反應。在這類反應中參與能量傳遞反應的標記物含量與免疫反應中抗原-抗體復合物形成的量呈正相關，并直接與反應底物產生的光子強度相關，該體系中的發光物質在激發態與基態的活動越強，產生的光子就越多，其發
射光的強度與被檢測物的濃度呈正相關。最常用的有三聯吡啶釕標記物。
A + B C* + D C* + F F* + E F* F + h （三）在臨床生化免疫檢測中的應用
無論是化學發光酶免疫測定，微粒子化學發光免疫測定和電化學發光免疫測定，目前都是采用將發光技術與免疫反應和計算機技術完美結合的自動化儀器分析，在這些分析技術中，由于其操作的智能化程度高，敏感度高、特異性強、精密度和準確性均可高于RIA，特別是檢測靈敏度高，快速，檢測試劑穩定并易于進行質量控制，目前已成為免疫檢測廣泛采用的分析技術。隨著近年來各試劑廠家不斷推出許多新開發的診斷試劑盒，使其檢測項目涉及面越來越廣，可用于內分泌激素類、腫瘤標志物類、心肌標志物類、病毒標志物類、治療性藥物濃度、骨代謝指標和貧血類等方面的檢測，是目前免疫化學應用最為廣泛的新技術。 四、
時間分辨熒光免疫分析
時間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassny，TRFIA）以鑭系元素為標記物，因此又稱之為"解離一增強鑭系熒光免疫分析"（dissociation－enhancement lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA）。它是一種全新的非放射性標記免疫超靈敏度的檢測技術。其主要特點是以稀土元素銪（Eu3+）標記抗原或抗體為示蹤劑。利用增強液的熒光放大作用和時間分辨熒光測量法排除樣品或試劑中非特異性熒光物質的干擾，最大限度地提高了熒光信號測量的特異性和檢測方法的靈敏度，最小檢出值可達10-17mol/L。具有操作方法簡便，標記物制備容易，穩定性好，不污染環境和易于自動化等優點。目前主要用于蛋白質類、酶、
***類激素、甲狀腺激素、類固醇激素、藥物等的定量檢測。
（一） 時間分辨熒光免疫分析原理
通常在檢測樣品中，含有各種蛋白質和其他化合物，這些物質在較大波長范圍內都可產生自發熒光，如血清蛋白可發射短波長熒光（激發波長為280nm，發射波長為320nm～350nm），而膽紅素等化合物可發射較長波長熒光（激發波長為330nm～360nm，發射波長為430nm～470nm）。這些熒光屬于非特異熒光，其熒光素壽命短，一般為lns～10ns，最長不超過20ns，因此，普通熒光素發射的熒光與非特異熒光的熒光壽命屬于短壽命熒光，在本檢測中稱背景
熒光。
鑭系離子有銪、衫（Sm3+）、鏑（Dy3+）等，其熒光壽命很長（10us～1.0ms），比背景熒
光長3～4個數量級。所以應用熒光的時間分辨技術在背景熒光已經降到很低時再開始檢測稀土鰲合物的熒光，從而消除了非特異性熒光的干擾。另外，較大的Stocks位移（即激發光波長與發射光波長之差）和較窄的發射峰等都增大了檢測的信噪比。由于使用解離-增強原理（即鑭系元素鰲合物被解離后形成一種處于保護性的膠態分子團中新的高強熒光鰲合
物）使得檢測的靈敏度進一步增加，可達5 10-14mol/L。
（二） 時間分辨熒光免疫分析的主要分析方法
1．雙位點夾心分析法 以甲胎蛋白（AFP）為例。采用針對AFP分子上不同決定簇的兩種單克隆抗體，一種抗體包被在微孔板上，另一種用作制備抗AFP-Eu3+標記物。在微孔板中加入待測樣品和標記物，AFP通過其兩個結合位點分別與固相和標記物中的抗AFP結合，結合到固相上的抗AFP-Eu3+標記物與AFP含量成正比，洗滌除去游離的標記物；加入增強液，用時間分辨熒光測定儀測定固相上結合標記物的熒光強度，它與AFP濃度呈正比。一系列AFP標準品用于制作標準曲線，通過樣品熒光強度可以從標準曲線查出樣品AFP含量。 2．競爭分析法 以皮質醇測定為例。Eu3+標記抗皮質醇抗體，微孔板上包被皮質醇。在微孔中加入樣品和Eu3+標記物，樣品與固相上的皮質醇對有限量抗皮質醇-Eu3+標記物進行競爭性結合，Eu3+標記物與固相結合量與樣品皮質醇含量成反比，洗滌除去游離的Eu3+標記物，加入增強液，用時間分辨熒光儀測定熒光強度，熒光強度與樣品皮質醇含量呈反比。一系列皮質醇標準品用于制作標準曲線，根據樣品熒光強度可以從標準曲線查出皮質醇含量。
（三）時間分辨熒光免疫分析的臨床應用
TRFIA技術在實驗室應用中已經取得較大的突破，全自動的時間分辨熒光免疫分析儀和多種商品化試劑盒的問世為TRFIA技術的臨床應用提供了必要的條件。由于它具有靈敏度高、重復性好、檢測線性范圍寬、信號穩定和熒光壽命長等優點，使得以前難以定量測定或測定不理想的物質可以方便的檢測。蛋白質和多***激素如Ig E、HCG、促黃體生成素、催乳素、促甲狀腺素、胰島素等可以用雙位點夾心法測定；半抗原的物質如皮質醇、地高辛、甲狀腺素、雌二醇等一般用競爭法測定；另外還可以用于病原體抗原、腫瘤標記物等的測定。由于時間分辨熒光免疫技術優點突出，發展迅速，將逐漸取代放射免疫分析技術。 第五節 其他
檢驗技術
臨床生化實驗技術很多，除上述介紹的技術外，還有離心技術、層析技術、生物傳感技術和
生物芯片技術等，這里選幾種適用的技術作簡要介紹。
