酶標抗體制備技術基本要求是將酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合既不改變抗體的免疫反應活性，也不影響酶的生物化學活性。用于標記抗體的酶較多，常用的有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。
（一）辣根過氧化物酶標抗體制備技術
辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）廣泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由無色酶蛋白和深棕色鐵卟啉（輔基）構成一種糖蛋白（含糖18%）。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。 HRP分子量較?。?0kDa），標記物容易穿透入細胞內部；作用底物為H2O2，以二氨基聯苯胺（DAB）為供氫體的反應產物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光鏡觀察；在pH3.5～12范圍內穩定，對熱及有機溶劑的作用亦較穩定，能耐受63℃加熱15min；用甲苯與石臘包埋切片處理或用純乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影響其活性；溶解性好，100mL緩沖鹽溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%飽和度以下的硫酸銨溶液中，故常用硫酸銨分級沉淀法分離純化；氰化物、硫化物、氟化物、及疊氮化物等對HRP的活性有抑制作用，應避免使用NaN3作為酶標試劑的防腐劑，以防止失活。
凡能在HRP和H2O2存在時被酶催化H2O2反應而和成有色產物的化合物（供氫體）都可以用顯色劑。供氫體的產物分不溶性和可溶性兩類。前者最常用的為3，3‘二氨基聯苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，適用于免疫組化法；反應后的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；這種多聚物還能還原和螯合四氧化餓，形成具有電子密度的產物，適用電鏡檢查；此外還有飽和聯苯胺溶液，氧化后產物呈黃褐色，多用于酶免疫擴散的深沉線顯色。后者最常用的為鄰苯二胺(O-phenylene
diamine,OPD)，產物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值為490nm，可用肉眼判別；易被濃酸終止反應，顏色可數小時不變，是ELISA中最常用的一種；但對光敏感，使用時要避光，并發現有致癌作用。
用HRP標記抗體需借助交聯劑的作用，將酶連接在抗體分子上。常用的交聯劑為過碘酸鈉和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。 1、改良過碘酸鈉法
HRP分子中與酶活性無關的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基形成schiff堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基反應發生自身偶聯，在標記前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封閉酶蛋白中殘存的α-和ε-氨基。酶與抗體的結合反應后，再加入硼氫化鈉(NaHB4）還原成穩定的結合物。
[標記步驟]
（1）取5mg HRP溶于0.5mL蒸餾水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB）無水乙醇溶液0.1mL，室溫（20℃±）下輕微攪拌作用1h。
（2）加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室溫下避光輕攪30min，溶液呈黃綠色。
（3）加入1mL0.16mol/L乙二醇，室溫（20℃±）下輕攪作用1 h，終止氧化反應。
（4）加入5mg抗體（Ig），裝入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸鹽緩沖液（無水碳酸鈉1.5g，碳酸氫鈉2.93g,蒸餾水加至1 000 mL）1 000 mL中，4℃透析過夜，更換3次。
（5）取出透析袋中液體（約3 mL），加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或過夜。
（6）加50%飽和硫酸銨（NH4）2SO4溶液（硫酸銨850g，蒸餾水加至1 000 mL，以30%氨水調pH7.2）6 mL沉淀結合物，置4℃30min后，3 000r/min離心30min，取深沉（SPA不需要進行此步）。 （7）將沉淀物溶于PBS（0.02M pH7.4）中，裝入透析袋，并以此緩沖液透析平衡6-12h，換液3次。
（8）在結合物內加入BSA至蛋白濃度為10mg/ mL，或加等量60%甘油，測定工作效價后，小量分裝（或凍干，不需加甘油），低溫保存備用。 2、戊二醛交聯法
戊二醛是一種常用的同型雙功能交聯劑，通過它的兩個醛基分別與HRP和抗體蛋白的氨基結合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白結合物。反應可在4-40℃溫度范圍，pH6.0～8.0 的緩沖溶液中進行，分為一步法和二步法，戊二醛一步法是將酶和待標記抗體混合，同時加入戊二醛進行交聯反應。戊二醛二步法是將酶先與戊二醛作用，形成酶-戊二醛結合物，結過透析或層析除去未結合的戊二醛，然后再與抗體結合。 [標記步驟]
（1）取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB將25%戊二醛稀釋為1.25%)，室溫（20℃左右）反應結合18h。
（2）用0.15mol/LNaCl平衡過的Sephadex G-50凝膠柱洗脫，除去游離的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析過夜。
（3）將5mg抗體IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再與醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。 （4）加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液（調節pH至9.0～9.6），4℃，電磁攪拌下結合24h。
（5）加入0.1mL0.2mol/L賴氨酸（0.29g溶于10mL蒸餾水），4℃放置2h，以封閉殘留的醛基，終止反應。
