蛋白質在哺乳動物體內代謝產生氨, 最終生成尿素, 這兩種物質也少量存在于它們的乳汁中。氨和尿素是乳汁中的非營養成分, 含量過高甚至對飲用者的身體有害。但有不法之徒為提高摻水牛奶的蛋白質檢測值, 置消費者的健康于不顧,在向牛奶中摻水的同時, 還加入銨鹽或尿素等含氮物。為保護消費者的權益, 打擊制假販假, 必須檢測牛奶中氨和尿素的含量。我們在原來工作[ 1 -2] 的基礎上, 采用黃豆粉水解液作脲酶, 水解尿素產生氨, 氨再由苯酚— 次氯酸鹽光度法測定,從而提出一種測定牛奶中氨和尿素的新方法, 該方有操作簡便, 靈敏度高, 結果準確等優點。
1 實驗部分
1.1 實驗原理
脲酶水解尿素產生氨。在堿性條件下, 氨由亞硝基鐵氰化鈉催化, 與苯酚和次氯酸鹽反應生成藍色可溶性物質, 此物質可用比色法測定。
1 .2 儀器與試劑 LAl64 電子分析天平(常熟市衡器廠):721型分光光度計(上海第三分析儀器廠):恒溫水浴等。脲酶溶液:稱取過60 目篩的黃豆粉25g , 置研缽內, 加少許70 %的甘油研磨, 再以70 %甘油稀釋至500ml , 混勻后靜置, 取上層液使用;0.5mol/ L 硫酸:28ml 濃硫酸, 溶于約800ml 無氨水中, 冷卻后補無氨水至1000ml ;10%鎢酸鈉溶液:稱取鎢酸鈉50g , 用無氨水溶解并稀釋至500ml;氨氮標準液:將硫酸銨(AR)烘干, 準確稱取0.4714g , 用無氨蒸餾水溶解, 并定容至1000ml, 為儲備液, 吸取5.00ml 儲備液, 用無氨蒸餾水稀釋, 定容至100ml, 即氨濃度為0 .005mg/ ml 的標準液:顯色液I :稱取苯酚25g , 亞硝基鐵氰化鈉0 .125g , 分別用無氨水溶解后混合,并稀釋至500ml;顯色液Ⅱ :稱取NaOH 12 .5g , 用無氨水溶解,加入20ml 安替福民(NaClO 含量為70g/L), 補無氨水至500ml 。
1 .3 實驗方法
1 .3.1 工作曲線的制作 吸取一定量的氨氮標準液于25ml具塞比色管中, 依次加入顯色液I 和顯色液Ⅱ 各2.5ml, 用無氨水定容至刻度, 搖勻后置37 ℃, 恒溫水浴保溫30min, 取出, 在620nm 下, 用1cm 比色皿, 以試劑空白作參比, 測定吸光度。
1 .3.2 牛奶中氨氮的測定 吸取2.5ml 待測牛奶, 加7.5ml無氨水稀釋, 再依次加入0 .5mol/L 硫酸1 .0ml 和10%鎢酸鈉1 .0ml, 搖勻后離心以3000r/min 離心10min, 取上清液0.250ml于25ml 具塞比色管中, 按1 .3.1 步驟顯色, 并測定吸光度。
1 .3.3 牛奶中尿素的測定 吸取2.5ml 待測牛奶, 加入等量無氨水, 搖勻, 再加入5 .0ml 脲酶溶液, 混勻后置37℃水浴中保溫30min, 取出, 依次加入0.5mol/ L 硫酸1.0ml 和10%鎢酸鈉1 .0ml, 搖勻后離心以3000r/min 離心10min, 取上清液0.250ml,于25ml 具塞比色管中, 按1 .3.1 步驟顯色, 并測定吸光度。2 結果與討論2.1 工作曲線 分別吸取0.0 、0.5、1.0、1.5 、2.0、2 .5 、3.0、3 .5、4 .0ml 氨氮標準液于9 只25ml 具塞比色管中, 按1.3 .1 步驟操作, 依據測定值繪制工作曲線。結果表明:氨氮濃度在0.0
-0.6mg/ L 范圍內符合比耳定律, 表現摩爾吸光系數ε620=1 .9×104mol/ L·cm-1 , 線性回歸方程A =1 .08CN(mg/L)-0.002 ,線性相關系數r =0.9992, 氮的檢出限為5 .6×10-6g/ L。2.2 樣品的測定 樣品按1.3.2 和1.3.3 步驟測定, 據測定的吸光度值, 在工作曲線上查出樣品管的氨氮濃度(mg/ L), 依王武生等的方法[ 13] , 將脲酶水解后所測氨氮值乘以90 , 即為每100ml 牛奶中尿素的毫克數。類比于此, 將按1 .3.2 步驟測出的氨氮值乘以51 , 即得每100ml 牛奶中氨的毫克數。
